Analiza kwasów nukleinowych

Print Friendly

Analiza kwasów nukleinowych

Wysokoprzepustowa izolacja DNA i RNA 

Izolacja kwasów nukleinowych z następujących materiałów wyjściowych:

  • Krew
  • Tkanki (homogenizacja mechaniczna lub, na życzenie, kriohomogenizacja)
  • Hodowle komórkowe
  • Ludzkie i zwierzęce wydaliny i wydzieliny
  • Bakterie (genom bakteryjny)
  • Wirusy (izolacja DNA wirusów z hodowli, krwi)
  • Bioślady (izolacja minimum 96 próbek) z wymazów nabłonka policzka, z bibuł (krwi z badań przesiewowych noworodków i innych biośladów)

Izolacja plazmidów (mini, midi, maxiprep) możliwa jest wyłącznie ręcznie!

Genotypowanie pojedynczych znanych mutacji

  • ARMS-PCR (amplification refractory mutation system) PCR specyficzna w stosunku do allelu
  • RFLP (restriction fragment length polymorphism) polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych – tylko w przypadku obecności w sekwencji miejsca rozpoznawanego przez restryktazy
  • HA (heteroduplex analysis) analiza hetero dupleksów za pomocą elektroforezy kapilarnej, możliwa w około 80% mutacji
  • HRM (high-resolution melting curve) – wysokorozdzielcza analiza temperatury topnienia za pomocą aparatu Qiagen Rotor Gene Q lub Roche LightCycler

Wszystkie powyższe techniki wymagają optymalizacji. W tym celu wymagane jest dostarczenie kontroli pozytywnej, zweryfikowanej sekwencjonowaniem bezpośrednim (Sangera lub pirosekwencjonowaniem). Czasami dla konkretnego rodzaju mutacji nie są możliwe żadne metody pośrednie i należy stosować sekwencjonowanie bezpośrednie.

Genotypowanie nieznanych mutacji 

  • Pirosekwencjonowanie – wysokoczułe sekwencjonowanie w poszukiwaniu konkretnych mutacji (długość sekwencji analizowanej ~80 pz) za pomocą Qiagen PyroMark Q24
  • NGS (next-generation sequencing) – sekwencjonowanie następnej generacji, pozwala na jednoczesne sekwencjonowanie wielu amplikonów w bardzo wielu próbkach w jednej probówce za pomocą Illumina MiSeq

Analiza metylacji

Analiza wybranych miejsc CpG za pomocą pirosekwenatora PyroMark Q24

Typowanie HLA (Illumina MiSeq)

TruSight HLA Sequencing Panel – 11 loci HLA

Analiza genów zaangażowanych w choroby  (Illumina MiSeq)

  • TruSight Cancer – panel nowotworowy >1700 eksonów, 94 geny (lista dostępna na stronie producenta i przy zapytaniu)
  • TruSight Tumor 15 – panel nowotworowy 15 genów
  • TruSight Tumor 26 – panel nowotworowy 26 genów
  • TruSight Cardio – 174 geny zaangażowane w 17 dziedzicznych chorób serca
  • TruSight Inherited Disease – 552 geny, regiony w których występują mutacje odpowiedzialne za choroby dziedziczne
  • TruSight Myeloid – 54 geny zaangażowane w nowotwory szpiku
  • TruSight Autism – 101 genów zaangażowanych w spektrum autyzmu/li>

Analiza metagenomu (Illumina MySeq 16s)

Oznaczanie występowania różnych gatunków bakterii w różnych materiałach:

  • Żywność
  • Ścieki
  • Ludzkie i zwierzęce wydaliny i wydzieliny

Oznaczanie obecności konkretnych gatunków bakterii

Real-time PCR za pomocą aparatu Qiagen Rotor Gene Q lub Roche LightCycler

Autor: Agata Kołacz, Opublikowano: 13.05.2016
plusfontminusfontreloadfont