Laboratorium Analizy DNA

Print Friendly

Laboratorium
Analizy DNA

Laboratorium Analizy DNA wyposażone jest w nowoczesną aparaturę zapewniającą wszechstronną analizę kwasów nukleinowych.

Świadczymy usługi w zakresie analiz DNA i RNA w szerokim spektrum próbek biologicznych, włączając materiał ludzki, mikrobiologiczny, zwierzęcy lub roślinny.

Wysokoprzepustowa błyskawiczna izolacja kwasów nukleinowych

Izolacja DNA i RNA aparaturą QIASymphony (min. 24 próbki; 96 próbek w około 7 godzin)

Izolacja kwasów nukleinowych z następujących materiałów wyjściowych:

  • krew
  • tkanki (homogenizacja mechaniczna lub, na życzenie, kriohomogenizacja)
  • hodowle komórkowe
  • ludzkie i zwierzęce wydaliny i wydzieliny
  • bakterie (genom bakteryjny)
  • wirusy (izolacja NA wirusów z hodowli, krwi)
  • bioślady (izolacja minimum 96 próbek) z wymazów nabłonka policzka, bibuł (krwi z badań przesiewowych noworodków) i innych biośladów

Izolacja plazmidów (mini, midi, maxiprep) możliwa jest wyłącznie ręcznie!

Oczyszczanie białek

Oczyszczanie aparaturą QIASymphony, białka z metką 6xHis

Genotypowanie pojedynczych znanych mutacji za pomocą wielu technik molekularnych różniących się kosztem, czułością i przepustowością

  • ARMS-PCR (amplification refractory mutation system) PCR specyficzna w stosunku do allelu
  • RFLP (restriction fragment length polymorphism) polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych – tylko w przypadku obecności w sekwencji miejsca rozpoznawanego przez restryktazy
  • HA (heteroduplex analysis) analiza heterodupleksów za pomocą elektroforezy kapilarnej, możliwa w około 80% mutacji
  • HRM (high-resolution melting curve) – wysokorozdzielcza analiza temperatury topnienia za pomocą aparatu Qiagen Rotor Gene Q lub Roche LightCycler

Wszystkie powyższe techniki wymagają optymalizacji. W tym celu wymagane jest dostarczenie kontroli pozytywnej zweryfikowanej sekwencjonowaniem bezpośrednim (Sangera lub pirosekwencjonowaniem). Czasami dla konkretnego rodzaju mutacji nie są możliwe żadne metody pośrednie i należy stosować sekwencjonowanie bezpośrednie.

Genotypowanie nieznanych mutacji za pomocą technik molekularnych różniących się kosztem, czułością i przepustowością

  • Pirosekwencjonowanie – wysokoczułe sekwencjonowanie w poszukiwaniu konkretnych mutacji (długość sekwencji analizowanej ~80 pz) za pomocą Qiagen PyroMark Q24
  • NGS (next-generation sequencing) – sekwencjonowanie następnej generacji, pozwala na jednoczesne sekwencjonowanie wielu amplikonów w bardzo wielu próbkach w jednej probówce za pomocą Illumina MiSeq

Analiza genów zaangażowanych w choroby za pomocą zoptymalizowanych zestawów Illumina (Illumina MiSeq)

  • TruSight Tumor 15 – panel nowotworowy 15 genów
  • TruSight Tumor 26 – panel nowotworowy 26 genów
  • TruSight Cancer – panel nowotworowy >1700 eksonów, 94 geny (listy genów dostępne na stronie producenta i przy zapytaniu)
  • TruSight Cardio – 174 geny zaangażowane w 17 dziedzicznych chorób serca
  • TruSight Inherited Disease – 552 geny, regiony w których występują mutacje odpowiedzialne za choroby dziedziczne
  • TruSight Myeloid – 54 geny zaangażowane w nowotwory szpiku
  • TruSight Autism – 101 genów zaangażowanych w spektrum autyzmu
  • TruSight One – 4,813 genów związanych ze znanymi fenotypami klinicznymi

Sekwencjonowanie NGS miRNA oraz celowane sekwencjonowanie RNA

  • oznaczanie mikroRNA z różnych organizmów i tkanek
  • celowane sekwencjonowanie transkryptów z różnych organizmów i tkanek

Małe genomy – sekwencjonowanie NGS

  • bakterie
  • drożdże
  • wirusy
  • fagi
  • mitochondria

Analiza szczepów bakteryjnych – metagenomika 16s

Oznaczanie gatunków bakterii w różnych materiałach

  • żywność
  • ścieki
  • ludzkie i zwierzęce wydaliny i wydzieliny

Elektroforeza kapilarna

Rozdział amplikonów / fragmentów DNA i RNA z rozdzielczością do 2 nukleotydów (analiza jakościowa i ilościowa)

Analiza metylacji DNA

Analiza wybranych miejsc CpG za pomocą pirosekwenatora PyroMark Q24

20130710044023pic1

Automat do izolacji DNA/RNA/białek QIASymphony (Qiagen)

homogenisers

Homogenizatory: TissueLyzerII (Qiagen) and CryoMill (Retsch)

nanodrops

Spektrofoto- and spektrofluorymetr NanoDrop 8000 and 3300 (ThermoFisher Scientific)

 Labcycler_00012_engTermocyklery SensoQuest

rotor_gene_Q

Termocykler real-time PCR (CEIVD) Rotor Gene Q (Qiagen)

3.8.1.5.1.1-large

Termocykler real-time PCR HT Light Cycler 480 (Roche)

 Laboratory pipetting robot

Stacja pipetująca Piro (DORNIER-LTF)

 Instrument_fragment_analyzer

Aparat do elektroforezy kapilarnej Fragment Analyzer (Advanced Analytical)

miseq-fgx-hero

Sekwenator NGS MiSeq (Illumina)

pyromarkQ24

Pirosekwenator PyroMark Q24 (Qiagen)

Budynek 4, III piętro, pok. 4.36 – biuro, 4.29, 4.31, 4.32 – laboratoria

Kierownik Laboratorium – dr Anna Tracewska (Siemiątkowska)

e-mail: anna.tracewska@eitplus.pl

tel. (71) 734 72 53; 727 66 55 61

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

p.o. kierownika (01.12.2016-30.06.2017)
dr Andrzej Kowalczyk

Granty

SONATA 10 (Narodowe Centrum Nauki)

Grant nr: 2015/19/D/NZ2/031

Tytuł: W stronę światła: odkrywanie genetycznych przyczyn dziedzicznych chorób siatkówki w Polsce

Czas trwania: 01.12.2016 – 31.05.2019

 

Publikacje kierownika laboratorium

  • van Huet RA, Siemiatkowska AM, Ozgül RK, Yücel D, Hoyng CB, Banin E, Blumenfeld A, Rotenstreich Y, Riemslag FC, den Hollander AI, Theelen T, Collin RW, van den Born LI, Klevering BJ. Retinitis pigmentosa caused by mutations in the ciliary MAK gene is relatively mild and is not associated with apparent extra-ocular features. Acta Ophthalmol. 2015;93:83-94.
  • Bujakowska KM, Zhang Q, Siemiatkowska AM, Liu Q, Place E, Falk MJ, Consugar M, Lancelot ME, Antonio A, Lonjou C, Carpentier W, Mohand-Saïd S, den Hollander AI, Cremers FP, Leroy BP, Gai X, Sahel JA, van den Born LI, Collin RW, Zeitz C, Audo I, Pierce EA. Mutations in IFT172 cause isolated retinal degeneration and Bardet-Biedl syndrome. Hum Mol Genet. 2015;24:230-42
  • Siemiatkowska AM, Schuurs-Hoeijmakers JH, Bosch DG, Boonstra FN, Riemslag FC, Ruiter M, de Vries BB, den Hollander AI, Collin RW, Cremers FP. Nonpenetrance of the most frequent autosomal recessive Leber congenital amaurosis mutation in NMNAT1. JAMA Ophthalmol. 2014;132:1002-4.
  • Siemiatkowska AM, Collin RW, den Hollander AI, Cremers FP. Genomic approaches for the discovery of genes mutated in inherited retinal degeneration. Cold Spring Harb Perspect Med. 2014;17;4. pii: a017137. (review)
  • van Huet RA, Collin RW, Siemiatkowska AM, Klaver CC, Hoyng CB, Simonelli F, Khan MI, Qamar R, Banin E, Cremers FP, Theelen T, den Hollander AI, van den Born LI, Klevering BJ. IMPG2-associated retinitis pigmentosa displays relatively early macular involvement. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014;55:3939-53.
  • Roosing S, Collin RW, den Hollander AI, Cremers FP#, Siemiatkowska AM#. Prenylation defects in inherited retinal diseases. J Med Genet. 2014;51:143-51. (review)
  • Siemiatkowska AM, van den Born LI, van Genderen MM, Bertelsen M, Zobor D, Rohrschneider K, van Huet RA, Nurohmah S, Klevering BJ, Kohl S, Faradz SM, Rosenberg T, den Hollander AI, Collin RW, Cremers FP. Novel compound heterozygous NMNAT1 variants associated with Leber congenital amaurosis. Mol Vis. 2014;20:753-9.
  • Siemiatkowska AM, van den Born LI, van Hagen PM, Stoffels M, Neveling K, Henkes A, Kipping-Geertsema M, Hoefsloot LH, Hoyng CB, Simon A, den Hollander AI,Cremers FP, Collin RW. Mutations in the mevalonate kinase (MVK) gene cause nonsyndromic retinitis pigmentosa. Ophthalmology. 2013;120:2697-705.
  • Neveling K, Collin RW, Gilissen C, van Huet RA, Visser L, Kwint MP, Gijsen SJ, Zonneveld MN, Wieskamp N, de Ligt J, Siemiatkowska AM, Hoefsloot LH, Buckley MF, Kellner U, Branham KE, den Hollander AI, Hoischen A, Hoyng C, Klevering BJ, van den Born LI, Veltman JA, Cremers FP, Scheffer H. Next-generation genetic testing for retinitis pigmentosa. Hum Mutat. 2012;33:963-72.
  • Paun CC, Pijl BJ, Siemiatkowska AM, Collin RW, Cremers FP, Hoyng CB, den Hollander AI. A novel crumbs homolog 1 mutation in a family with retinitis pigmentosa, nanophthalmos, and optic disc drusen. Mol Vis. 2012;18:2447-53.
  • Siemiatkowska AM*, Astuti GD*, Arimadyo K, den Hollander AI, Faradz SM, Cremers FP, Collin RW. Identification of a novel nonsense mutation in RP1 that causes autosomal recessive retinitis pigmentosa in an Indonesian family. Mol Vis. 2012;18:2411-9.
  • Ozgül RK*, Siemiatkowska AM*, Yücel D*, Myers CA, Collin RW, Zonneveld MN, Beryozkin A, Banin E, Hoyng CB, van den Born LI; European Retinal Disease Consortium, Bose R, Shen W, Sharon D, Cremers FP, Klevering BJ, den Hollander AI, Corbo JC. Exome sequencing and cis-regulatory mapping identify mutations in MAK, a gene encoding a regulator of ciliary length, as a cause of retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 2011;89:253-64.
  • Collin RW, van den Born LI, Klevering BJ, de Castro-Miró M, Littink KW, Arimadyo K, Azam M, Yazar V, Zonneveld MN, Paun CC, Siemiatkowska AM, Strom TM, Hehir-Kwa JY, Kroes HY, de Faber JT, van Schooneveld MJ, Heckenlively JR, Hoyng CB, den Hollander AI, Cremers FP. High-resolution homozygosity mapping is a powerful tool to detect novel mutations causative of autosomal recessive RP in the Dutch population. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011;52:2227-39.
  • Siemiatkowska AM*, Arimadyo K*, Moruz LM, Astuti GD, de Castro-Miro M, Zonneveld MN, Strom TM, de Wijs IJ, Hoefsloot LH, Faradz SM, Cremers FP, den Hollander AI, Collin RW. Molecular genetic analysis of retinitis pigmentosa in Indonesia using genome-wide homozygosity mapping. Mol Vis. 2011;17:3013-24.
  • Bandah-Rozenfeld D, Collin RW, Banin E, van den Born LI, Coene KL, Siemiatkowska AM, Zelinger L, Khan MI, Lefeber DJ, Erdinest I, Testa F, Simonelli F, Voesenek K, Blokland EA, Strom TM, Klaver CC, Qamar R, Banfi S, Cremers FP, Sharon D, den Hollander AI. Mutations in IMPG2, encoding interphotoreceptor matrix proteoglycan 2, cause autosomal-recessive retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 2010;87:199-208.
  • Siemiatkowska A, Bieniaszewska M, Hellmann A, Limon J. JAK2 and MPL gene mutations in V617F-negative myeloproliferative neoplasms. Leuk Res. 2010;34:387-9.
  • Duchnowska R, Siemiatkowska A, Grala B, Smoter M. [Long-term remission after erlotinib therapy in an elderly patient with advanced non-small-cell lung cancer. Case report and conclusions for clinical practice]. Pneumonol Alergol Pol. 2008;76:451-5.
  • Kanka C, Brozek I, Skalska B, Siemiatkowska A, Limon J. Germline NBS1 mutations in families with aggregation of breast and/or ovarian cancer from north-east Poland. Anticancer Res. 2007;27:3015-8.
  • Dziadziuszko R, Siemiatkowska A, Limon J, Rzyman W, Jassem J, Bunn PA Jr, Varella-Garcia M, Hirsch FR. Unusual chemosensitivity of advanced bronchioalveolar carcinoma after gefitinib response and progression: a case report. J Thorac Oncol. 2007;2:91-2.
  • Haack B, Kupka S, Ebauer M, Siemiatkowska A, Pfister M, Kwiatkowska J, Ereciński J, Limon J, Ochman K, Blin N. Analysis of candidate genes for genotypic diagnosis in the long QT syndrome. J Appl Genet. 2004;45:375-81.31.

* – equal contribution of the first authors
# – equal contribution of the last authors

Paweł Paszkowski

Opiekun Klienta

Paweł Paszkowski

tel: 727 663 380

pawel.paszkowski@eitplus.pl

Autor: Agata Kołacz, Opublikowano: 02.02.2016
plusfontminusfontreloadfont